Hæmoglobinelektroforeseeksperiment

Eksperimentprincip

Hæmoglobinelektroforese har til formål at detektere og bekræfte forskellige normale og unormale hæmoglobiner.

På grund af de forskellige ladninger og isoelektriske punkter af forskellige hæmoglobintyper, i en bestemt pH-bufferopløsning, når det isoelektriske punkt for hæmoglobin er lavere end pH-værdien af ​​bufferopløsningen, bærer hæmoglobin en negativ ladning og migrerer mod anoden under elektroforese. Omvendt bevæger hæmoglobin med en positiv ladning sig mod katoden.

Under en bestemt spænding og efter en specifik elektroforesetid udviser hæmoglobiner med forskellige ladninger og molekylvægte forskellige migrationsretninger og -hastigheder. Dette giver mulighed for adskillelse af distinkte zoner, og efterfølgende kolorimetrisk eller elektroforetisk scanningsanalyse kan udføres på disse zoner for at kvantificere forskellige hæmoglobiner. Den mest almindeligt anvendte metode er pH 8,6 celluloseacetatmembranelektroforese.

Inden for cytoplasmaet oxideres ethylenglycolgrupper (CHOH-CHOH), der er til stede i glykogen eller polysaccharidstoffer (såsom mucopolysaccharider, mucoproteiner, glycoproteiner, glycolipider osv.) af perjodsyre og omdannes til aldehydgrupper (CHO-CHO). Disse aldehydgrupper kombineres med det farveløse lilla-røde Schiff-reagens og danner et lilla-rødt farvestof, der aflejres, hvor polysaccharider er til stede i cellen. Denne reaktion er kendt som periodisk syre-Schiff (PAS) farvning, tidligere omtalt som glykogenfarvning.

Eksperimentmetode

Materialer:Celluloseacetatmembrane, elektroforeseapparater(DYCP-38C og strømforsyning DYY-6C), Superior prøveindlæsningsværktøj (pipette), spektrofotometer, kolorimetriske kuvetter, buffere.

Buffer:

(1) pH 8,6 TEB-buffer: Vej 10,29 g Tris, 0,6 g EDTA, 3,2 g borsyre, og tilsæt destilleret vand til 1000 ml.

(2) Boratbuffer: Vej 6,87 g borax og 5,56 g borsyre, og tilsæt destilleret vand til 1000 ml.

Procedure:

Preparation af hæmoglobinopløsning

Tag 3 ml blod indeholdende heparin eller natriumcitrat som antikoagulant. Centrifuger ved 2000 rpm i 10 minutter og kassér plasmaet. Vask de røde blodlegemer tre gange med fysiologisk saltvand (750 rpm, 5 minutters centrifugering hver gang). Centrifuger ved 2200 rpm i 10 minutter og kassér supernatanten. Tilsæt en lige stor mængde destilleret vand, og tilsæt derefter 0,5 gange volumenet af carbontetrachlorid. Ryst kraftigt i 5 minutter, og centrifuger derefter ved 2200 rpm i 10 minutter for at opsamle den øvre Hb-opløsning til senere brug.

Iblødsætning af membranen

Skær celluloseacetatmembranen i strimler, der måler 3 cm × 8 cm. Læg dem i blød i pH 8,6 TEB-buffer, indtil de er helt mættede, fjern dem og tør dem med filterpapir.

Spotting

Brug en pipette til at spotte 10 μl af hæmoglobinopløsningen lodret på celluloseacetatmembranen (den ru side), ca. 1,5 cm fra kanten.

Elektroforese

Hæld boratbufferopløsningen i elektroforesekammeret. Placer celluloseacetatmembranen med den plettede side ved katodeenden af ​​kammeret. Kør ved 200 V i 30 minutter.

Eluering

Skær HbA- og HbA2-zonerne ud, anbring dem i separate reagensglas, og tilsæt henholdsvis 15 ml og 3 ml destilleret vand. Ryst forsigtigt for at eluere hæmoglobinet fuldstændigt, og bland derefter.

Kolorimetri

Nulstil absorbansen med destilleret vand til elueringsopløsningen, og mål absorbansen ved 415 nm.

Beregning

HbA2(%) = Absorbans af HbA2-rør / (Absorbans af HbA-rør × 5 + Absorbans af HbA2-rør) × 100 %

Eksperimentel resultatberegning

Referenceområde for pH 8,6 TEB-buffer celluloseacetatelektroforese: HbA > 95 %, HbA2 1 %-3,1 %

Noter

Elektroforesetiden bør ikke være for lang. Celluloseacetatmembranen bør ikke tørre ud under elektroforese. Stop elektroforese, når HbA og HbA2 er tydeligt adskilt. Langvarig elektroforese kan forårsage bånddiffusion og sløring.

Undgå at bruge for meget prøve. Overdreven hæmoglobinvæske kan føre til båndløsning eller utilstrækkelig farvning, hvilket resulterer i falsk forhøjede HbA-niveauer.

Forebyg kontaminering af celluloseacetatmembranen med proteiner.

Strømmen bør ikke være for høj; ellers kan hæmoglobinbåndene muligvis ikke adskilles.

Inkluder altid prøver fra normale individer og nødvendige kendte unormale hæmoglobiner som kontroller.

Beijing Liuyi Biotechnology fremstiller den professionelle elektroforesetank til hæmoglobinelektroforese, der er modellenDYCP-38Ccelluloseacetatmembranelektroforesetank, og der er to modeller af elektroforesestrømforsyning til rådighed til celluloseacetatmembranelektroforesetankenDYY-2CogDYY-6Cstrømforsyning.

I mellemtiden leverer Beijing Liuyi Biotechnology celluloseacetatmembran til kunder, og størrelsen på celluloseacetatmembran kan tilpasses. Velkommen til at spørge os om prøver og mere information.

Beijing Liuyi-mærket har mere end 50 års historie i Kina, og virksomheden kan levere stabile produkter af høj kvalitet over hele verden. Gennem mange års udvikling er den værdig til dit valg!

Vi søger nu partnere, både OEM elektroforesetank og distributører er velkomne.

Hvis du har en købsplan for vores produkter, så tøv ikke med at kontakte os. Du kan sende os en besked på e-mail[e-mail beskyttet]eller[e-mail beskyttet], eller ring til os på +86 15810650221 eller tilføj Whatsapp +86 15810650221 eller Wechat: 15810650221